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      ELISA 常見問題解決方案匯總

      作者:丁香園 發布時間:2014-10-20

      ELISA 實驗因其靈敏度較高、特異性較好而廣泛應用于臨床上,但操作中的各環節對檢測效果影響較大,稍不注意,就有可能導致顯色不全、花板。

      問題主要集中在這幾個方面:選材、加樣、孵育、洗板、顯色、終止、讀板。問題及解決方案具體解析如下:

      選材

      選擇質量優良的檢測試劑(可以看下 ELISA 試劑盒選購經驗總結篇),操作前將試劑在室溫下平衡 30-60 分鐘。

      加樣

      出現問題可能原因
      1. 
      血清或血漿標本分離不好即進行加樣。
      2. 
      手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內溫度較高時)。
      3. 
      加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。

      解決方案
      1. 
      標本為血清:最好將血液先自然存放 1-2 小時后,再用 3000 rmp 離心 15 分鐘;標本為血漿:必須使用含抗凝劑的血液標本收集管,采血后必須立即顛倒采血管混合 5-10 次,放置一段時間后,3000 rpm 離心 15 分鐘;若在幾天內檢測,可放在 2-8℃冰箱中,若要貯存,則置于 -20℃的低溫冰箱內。
      2. 
      加樣后及時放入孵箱。
      3. 
      加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。
      4. 
      如果采用 AT 或其他全自動加樣,最好選擇 FAME 或其他后處理儀器加酶試劑。
      5. 
      標本較多時,請分批操作。

      孵育

      出現問題可能原因
      1. 
      孵育時未貼封片或加蓋,使標本或稀釋液蒸發,吸附于孔壁,難于清洗徹底。
      2. 
      孵育時間人為延長,導致非特異性結合緊附于反應孔周圍,難以清洗徹底。

      解決方案
      1. 
      貼封片或加蓋;
      2. 
      按說明步驟嚴格控制操作時間。

      洗板

      出現問題可能原因
      1. 
      采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。
      2. 
      采用半自動洗板機洗板時,洗液量不足,導致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全;洗板不暢,導致洗板效果差。
      3. 
      反應板過多造成洗板等待時間長。

      解決方案
      1. 
      保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干。
      2. 
      合理安排,或多用幾臺洗板機。

      顯色

      出現問題可能原因
      1. 
      顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑。
      2. 
      加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。

      解決方案
      1. 
      顯色劑盡量在臨用前配制,堅持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍色的 TMB 顯色劑不用。
      2. 
      加樣時保持顯色劑不外流。
      3. A
      、液應避免接觸金屬器械。

      終止

      出現問題可能原因
      加終止液時產生較多氣泡,導致假陽性增加。

      解決方案
      加終止液時應避免產生氣泡。

      讀板

      出現問題可能原因
      讀板時板底不清潔。

      解決方案
      應保證酶標板清潔。

      全過程

      1. 
      整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。
      2. 
      實現 ELISA 檢測標準自動化,有效提高檢測質量。

       文章來源:丁香園

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