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      Real-time qPCR 常見問題分析

      作者:廈門施科生物 發布時間:2014-08-01
      1. 做標準曲線時候,可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對于內參和目的基因?
      建議最好用同樣稀釋倍數做曲線,因為模板濃度會影響擴增效率。
      2. 熔解曲線中,Tm不出現在80度左右?
      擴增片段100bp左右的,一般應該出現在80度左右。如果低于此溫度出現,可能是模板降解。
      3. 擴增曲線沒有Ct值,僅僅一條斜線?什么原因?
      模板濃度過低或者模板降解。
      4. ROX 校正為何可以導致熔解峰的不專一?
      ROX也是一種熒光染料,會有熒光的發生。
      5. 如果內參和目標基因表達量差別比較大,也就是目的基因的表達量少,
      Ctcon=15,Cttarget=38,可否應用?
      可以用于數據分析。因為表達量低,從而用過高模板進行擴增,從而同內標的模板不同,反而會增大數據統計的誤差。
      6. 引物濃度可否是50nM,是否太低?
      如果擴增曲線和熔解曲線比較好,這個濃度當然可以。如果更低,擴增結果好的情況下,同樣可以運用。
      一句話,所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的,會影響擴增效率。
      7. miRNA多個擴增時候,如果一個的擴增效果比較,其它熔解曲線不止一個峰,如何解決?
      Primer對于miRNA是專一的。所以重新設計引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應體系會影響反應產物的。
      8. miRNA反轉錄引物和定量方法?與mRNA發轉錄及real-time PCR有和區別?
      一般常用的反轉錄primer有2種,一種是step-loop的primer;一種是首先3末端加A,然后ployT再發轉錄。
      用于real-time qPCR的上游primer都是針對miRNA結構本身的;下游有個通用primer。定量可以用SYBR Green I,也可以用Taqman。
      9. 相對定量方法,如果用Ct值比較,是各個樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好?
      相對定量的方法各有優缺點,主要取決于實驗的目的和材料的準備。如果是材料群體個體差異不大,這2種方法基本沒有很大的區別;如果是個體差異比較大,建議用雙標準曲線做。就是分別做內參和目的基因的標準曲線,分別帶入Ct值計算。
      10. 熔解程序可否不加?
      如果是擴增效果好,特異擴增,可以不加熔解程序;但建議做好加上。
      11. 擴增反應體系5μL,擴增效率低,什么原因?
      反應體系小,各種因素的影響比較大,比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會影響擴增效率的。
      12. 如何減少非特異性擴增的干擾?
      設計一對好引物,提高primer的退火溫度,以及設定吸光溫度。

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