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      說說抗體選擇那些事

      作者:巴傲得 發布時間:2014-11-11
       隨著生命科學的發展,圍繞蛋白進行的研究越來越多,抗體試劑在實驗中的重要性越來越舉足輕重。面臨著紛呈復雜的抗體試劑市場,如何選擇到適合自己實驗的抗體就變得尤為重要。

      一、關于特異性的選擇

      特異性的選擇主要需要考慮四個方面:蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標記物的特異性。

      1、蛋白特異性

      針對需要檢測的蛋白查找抗體,幾個細節要區分,重組表達的蛋白和內源性蛋白的檢測,對抗體的要求是不一樣的,注意查看抗體說明書的檢測說明。如果重組蛋白不是全長表達,則需要注意抗體的免疫原區域是否在重組蛋白區域內。內源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式,特殊表型的蛋白需要進行序列比對,并結合抗體免疫原序列,查看交叉反應的情況。 磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點,不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在,不宜一概而論。

      2、種屬特異性

      同種蛋白不同物種,有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設計多肽抗原的,根據蛋白的同源性情況與其他種屬發生交叉反應。需要 參照說明書注明的可反應種屬信息。一些稀有種屬很難找到抗體,可以通過蛋白的序列比對,選擇同源序列免疫的抗體,不過一般這種情況生產商不會受理其關于質量的申訴,如果可以申請到免費的抗體樣品,則利于抗體選擇。

      3、實驗方法特異性

      目前使用抗體的實驗方法有很多,不同的使用方法過程中,因為對蛋白樣品的處理方式不一樣,蛋白的含量有差異,對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。具體的根據說明書注明的產品應用方法進行選擇。但是生產商一般不會將每個抗體都進行各種實驗的檢測,目前檢測比較多的只是 WB、IHC、IF 等,如果針對具體的實驗方法沒有找到合適的抗體的,可以結合蛋白序列分析和抗體的抗原信息,選擇盡可能有效果的抗體。同樣,申請到免費的抗體樣品是個很好的途徑。

      4、標記物的特異性

      一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標記的一抗,比如 WB、IHC 等,都是通過二抗類的試劑標記達到結果呈現的目的。但是基于儀器分析的一些實驗,可能就會使用到直接標記的一抗,比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍,針對不通的參數要求選擇對應的標記物。在免疫熒光雙標實驗中,需要選配不同的熒光標記物。

      二、抗體種屬來源的選擇

      有人認為單抗比多抗好,其實這并不是一個嚴謹的觀點,只能說在可能性上單抗的特異性更好一些,而多抗的親和力會優于單抗,并且特異性并不一定就遜于單抗,主要看抗原的設計水平。目前商品化抗體里單抗主要是鼠單抗、兔單抗,多抗主要是兔多抗、山羊多抗等,其他種屬來源抗體較少。不建議糾結于單抗好還是多抗好,能做出實驗的抗體就是好抗體。

      在選擇上一般建議實驗種屬和抗體種屬親緣性越遠越好,不宜同源??贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標實驗中,需要在區別于實驗種屬的基礎上,區分開兩個指標的抗體種屬來源,以便于二抗區別識別。

      三、性價比的選擇

      抗體的品質高低最終還是需要通過實驗結果來呈現的,但是在選擇抗體之前我們并無法準確判斷抗體的效果如何。無論什么品牌的,無論進口還是國產的,都會有用得不錯的產品,也都會有做不出來的產品??贵w屬于異質化產品,不同品牌之間,甚至同一品牌的不同產品之間,抗體品質差異都較為明顯,而且沒有統一的衡量標準。這是抗體選擇中最難的一個問題。很多人習慣于根據實驗室傳統意識或參考文獻上使用的產品進行選擇,但是因為不同批次間的抗體效果也是有差異的,所以并不能完全確保正確選擇。在這種情況下,抗體的售后就尤為重要,遇到抗體品質障礙時,能夠確保有效地解決問題,不至于影響實驗的進展?,F在有部分品牌可以提供免費的抗體小樣的,無疑對這個問題是一個很好的解決方案。先確定抗體是否適合自己的實驗,可以避免因為抗體質量投訴耽誤實驗安排。

      在價格方面,需要謹記,最貴的不一定就是最好的,最適合你的實驗的才是最好的?;ê芏噱X買到很貴的抗體,再花上很長的時間去投訴的情況并不少見。只買對的,不買貴的。 在選擇價格的時候還要注意規格大小、抗體濃度、效價范圍等,要綜合考慮。在規格方面,根據最終可以稀釋成的工作液的量的來衡量更為準確。很多老品牌提供的抗體產品基本都是以大包裝為主,就單個課題的實驗而言,過大的包裝有時會造成很大的浪費。目前 Proteintech、Bioworld、Cell Signal 等品牌都相繼推出小包裝的抗體,這在一定程度上給選擇者更大的選擇自由度,可以根據試用產品的效價,計算出自己實際需要的抗體量,做到精確定量采購。

      四、品牌的選擇

      因為抗體品質的異質化,關于抗體的品牌選擇就被大家所重視,但是不管是什么品牌都難免會遇到不適合自己實驗的抗體。所以一般建議考慮那些業內普遍認可、購買方便、技術支持專業、售后處理便捷的品牌。一些甚至都沒有正式代理的,只能備選。同時購買時一定要找能夠提供產品指導、實驗分析、售后處理的正規代理商購買,避免因為買到假貨水貨影響實驗。

      五、其他小細節

      抗體選擇與使用過程中,多少還會遇到一些意想不到的事情。有些細節,還是需要多注意一些。如在選擇做阻斷或中和實驗時,有時需要將抗體加到細胞培養液中,這是需要注意抗體是否含有疊氮鈉。如果是大包裝的抗體,進行分裝是比較節約的方式,如果是高效價的,可以配成母液再分裝??贵w的短時間運輸,用普通冰塊保持溫度是可以滿足要求的。

      另外不要糾結于 WB 過程中分子量的問題。很多時候,我們看到同樣的抗體,不同的品牌,甚至同一品牌不同的貨號,標注的分子量都不一樣。其實可能只是生產商只檢測時使用了不同的種屬不同的樣品類型,或是參照了不同的文獻,對使用者來說,同樣的樣品,不管使用哪個品牌的,只要抗體是對的,目的條帶只會出現在相同的位置。關于分子量的問題,一般不建議看產品說明,WB 中條帶的位置由樣品決定,并不會因為抗體不同而不同。所以在檢測蛋白之前,我們可以通過數據庫或參考文獻,對將要檢測的蛋白做個比較全面的了解,包括其可能剪切與修飾的情況、表型的情況等。在第一次使用一個新的抗體時,不要根據分 子量橫向剪膜,可以保留幾個全泳道,看看條帶位置或分布的情況。


      文章來源:丁香園